Vaughn wird verdächtigt, als Doppelagent für eine terroristische Organisation namens „Prophet Five“ zu arbeiten und steht deshalb unter Beobachtung. Sydney hadert mit der Situation und stellt ihre ganze Beziehung in Frage. Das ist noch nicht alles: Sie erwartet ein Kind von ihm. Verzweifelt versucht sie, die Wahrheit über den Vater ihres ungeborenen Babys herauszufinden.

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Obwohl Auftragskillerin Renée Rienne zu den meistgesuchten Kriminellen der CIA gehört, arbeitet Sydney mit ihr zusammen. So will sie den Mörder von Vaughn fassen. Währenddessen ist Jack auf der Suche nach einem Ersatz für den Verstorbenen. Er will Thomas Grace engagieren, der zunächst zurückhaltend auf das Angebot reagiert.

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Sydney hat den ersten Einsatz mit ihrem neuen Partner Thomas Grace. Gemeinsam mit Marshall reisen die beiden nach Prag, um dort nach den Dieben zu suchen, die ein tödliches Virus gestohlen haben. Dabei stoßen sie auf Rachel Gibson, die für eine Organisation namens „The Shed“ arbeitet. Diese wurde von Gordon Dean gegründet und richtet ihre Aktivitäten gegen die USA. Sydney und Tom wollen Rachel dazu bringen, ihnen Informationen zu liefern.

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Sydney und Rachel reisen erneut nach Prag und suchen in den Ruinen des ehemaligen Büros von „The Shed“ nach Deans Computer. Mit dessen Hilfe wollen sie die Bankverbindung des Verräters knacken und seine Konten leer räumen. Doch Dean entdeckt schneller als gedacht, dass Rachel nicht tot ist. Dadurch geraten die beiden Frauen in große Gefahr.

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Sydney und Tom reisen nach Marseille. Dort stellen sie fest, dass Renée einen Kühlcontainer gestohlen hat, in dem sich der Körper ihres vermeintlich toten Vaters befindet. Eine Gruppe Söldner will den Mann aus dem Gefrierschlaf erwecken und ins Leben zurückholen. Währenddessen versuchen Rachel, Dixon und Marshall, eine Datei zu öffnen, die Informationen über Renées Vater enthält.

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Sydney und das Team der APO sind in Indien damit beschäftigt, den Waffenhändler Janos Vak dingfest zu machen. Deshalb muss Rachel zu ihrem ersten Solo-Einsatz aufbrechen: Sie soll Computersoftware von Janos stehlen. Nur damit kann das Versteck einer neuartigen, gefährlichen Waffe gefunden werden. Sydney gibt ihrer Kollegin zwar wertvolle Tipps, doch durch ihre Schwangerschaft ist sie selbst beeinträchtigt und kann Rachel nicht wirklich helfen.

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Sydney und die APO versuchen herauszufinden, für wen Gordon Dean arbeitet und welches Endziel er anstrebt. Sie vermuten eine Verbindung zu „Prophet Five“. Währenddessen erhält Sloane ein Angebot von einem geheimnisvollen Fremden: Er soll Dean töten. Nadia erwacht entgegen aller Prognosen aus dem Koma.

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Im Auftrag der APO soll Rachel in Sao Paolo Informationen über eine Mikrowellen-Bombe suchen. Sie ist allerdings nicht die Einzige mit diesem Ziel. Bald finden Rachel und Sydney heraus, wer ihr Gegner ist: Sark. Zur selben Zeit wird Jack Opfer einer Entführung.

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Während Kelly Peyton Software aus einem CIA-Warenlager stiehlt, wird Sydney von Mitgliedern des „Prophet Five“ entführt und in Hypnose versetzt. In diesem Zustand „begegnet“ sie ihrer großen Liebe Michael wieder. So will „Prophet Five“ ihr geheime Informationen entlocken. Um die Agentin zu befreien, bleibt Jack nichts anderes übrig, als mit Renée zusammenzuarbeiten.

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Sydney sitzt in den Räumen der CIA fest. Ein Maulwurf, der für „Prophet Five“ arbeitet, will damit verhindern, dass ihre Nachrichten die APO erreichen. Doch die Kollegen der Agentin schöpfen Verdacht und wollen sie befreien. Dabei geraten sie in eine Falle. Dank der Hilfe von Weiss können sie jedoch entkommen. Schließlich findet Jack heraus, wer Sydneys Einsatz sabotiert hat.

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Die Geburt von Sydneys Kind steht kurz bevor. Da bekommt die Agentin unerwartet Besuch von ihrer Mutter Irina. Gemeinsam mit Jack reisen die beiden Frauen nach Vancouver, um dort nach Informationen über „The Horizon“ zu suchen. Doch das Trio gerät in einen Hinterhalt. Während Jack den Kampf mit Kelly Peyton aufnimmt, setzen bei Sydney die Wehen ein.

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Nach der Geburt ihres Kindes beschließt Sydney, eine Pause als Agentin einzulegen. Da gelingt Anna Espinosa mit der Hilfe von Kelly Peyton die Flucht aus dem Gefängnis. Anna erkennt sofort, dass sie Sydney über deren Freunde aus der Reserve locken kann und entführt Will. Natürlich setzt die Agentin alle Hebel in Bewegung, um ihren Freund zu retten.

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Sydney und das Team der APO versuchen immer noch, hinter die Pläne von „Prophet Five“ zu kommen. Sloane gelangt endlich an ein Heilmittel, das Nadia retten kann. Es ist ihm egal, dass die Medizin von Prophet Five stammt. Erste Zweifel kommen ihm erst, als er erfährt, dass er Nadias Herz für 30 Sekunden anhalten muss, um das Mittel erfolgreich zu verabreichen. Unterdessen ist Sydney auf der Suche nach Anna. Sie ahnt nicht, dass diese durch das Projekt Helix zu ihrer Doppelgängerin gemacht wurde.

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Die Zusammenarbeit mit „Prophet Five“ schadet Sloane. Immer wieder wird er von schrecklichen Visionen geplagt. Währenddessen wird in Renées totem Körper ein Chip gefunden. Mit dessen Hilfe versucht Sydney, Kontakt zu Vaughn aufzunehmen.

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Um mehr über die Pläne von Prophet Five zu erfahren, gibt sich Sydney weiterhin als Anna aus. Dafür muss sie mit Sark zusammenarbeiten. Gemeinsam suchen sie nach einem wichtigen Hinweis in Bezug auf die Rambaldi Artefakte, der in einem italienischen Gefängnis versteckt sein soll. Die Zeit drängt. Denn auch Sloane und Kelly Peyton sind hinter dieser Information her.

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Sloane hält Rachel und Marshall gefangen und will sie zwingen, ihm bei der Suche nach dem letzten Hinweis auf die Rambaldi Artefakte zu helfen. Während Sydney, Vaughn und der Rest der APO versuchen, ihre Freunde zu befreien, schmiedet Sloane mit Sark und Peyton Pläne, wie sie „Prophet Five“ übernehmen können.

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Die APO wurde zerstört. Jetzt müssen Sydney und Jack unter allen Umständen verhindern, dass Irina und Sloane ihren tödlichen Plan in die Tat umsetzen und Rambaldis Prophezeiung erfüllen.

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